tud Molekularbiologische Charakterisierung von Häm-Thiolat- und DyP-type-Peroxidasen ausgewählter Basidiomyceten 2016-12-08 [Electronic ed.] 4519974-7 Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden prv Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, Dresden Internationales Hochschulinstitut Zittau Department für Bio- und Umweltwissenschaften male Leipzig Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe. For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats. 570 WD 5050 Chlorperoxidase, ClassII-Peroxidase, P450, Agrocybe aegerita, UPO, Unspezifische Peroxygenase, DyP, Dye-decolorizing-Peroxidase, Dikarya chloroperoxidase, classII peroxidase, P450, Agrocybe aegerita, UPO, unspecific peroxygenase, DyP, dye decolorizing peroxidase, Dikarya Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 5 2. Theoretische Grundlagen 7 2.1. Hämperoxidasen 7 2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7 2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10 2.1.3. Systematik 16 2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36 2.3. DyP-type-Peroxidasen 38 3. Anliegen der Arbeit 41 4. Material und Methoden 43 4.1. Organismen 43 4.2. Chemikalien 53 4.3. Methoden 55 4.3.1. Kultivierung 55 4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56 4.3.3. PCR 57 4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62 4.3.5. Protein-Sequenzierung 62 4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63 4.3.7. Genomsequenzierungen 73 4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76 4.3.9. Phylogenetische Analysen 77 4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79 4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80 4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83 4.3.13. SDS-PAGE 83 4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83 4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85 4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium 89 5. Ergebnisse 91 5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91 5.1.1. Sequenzen 91 5.1.2. Phylogenetische Analyse 110 5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113 5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116 5.2. DyP-type-Peroxidasen 126 5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126 5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130 5.2.3. Phylogenetische Analyse 135 5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137 5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142 6. Diskussion 143 6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143 6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144 6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 147 6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150 6.2.3. Biologische Funktion 152 6.2.4. Phylogenetik 154 6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159 6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165 6.3. DyP-type-Peroxidasen 166 6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166 6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168 6.3.3. Biologische Funktion 168 6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169 6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170 6.3.6. Heterologe Expression 171 7. Ausblick 173 8. Thesen 177 Literaturverzeichnis 179 A. Peptidsequenzen 225 B. Genspezifische Oligonukleotide 231 C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241 D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255 E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261 F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267 G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271 H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275 I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283 J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285 K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289 L. Publikationen 293 Danksagung 371 Rechtliche Erklärungen 373 urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-209428 481114807 Technische Universität Dresden dgg Technische Universität Dresden, Zittau Marek Pecyna 1978-11-02 aut Martin Hofrichter Prof. Dr. dgs rev René Ullrich Dr. dgs Ursula Kües Prof. Dr. rev Veiko Krauß PD Dr. rev ger 2015-10-30 2016-05-30 https://doi.org/10.1007/s00253-009-2000-1 Marek J. Pecyna, René Ullrich, Britta Bittner, André Clemens, Katrin, Scheibner, Roland Schubert, Martin Hofrichter: Molecular characterization of aromatic peroxygenase from Agrocybe aegerita. In: Appl Microbiol Biotechnol October 2009, Volume 84, Issue 5, pp 885–897 DOI 10.1007/s00253-009-2000-1 https://doi.org/10.1007/s00253-010-2633-0 Martin Hofrichter, René Ullrich, Marek J. Pecyna, Christiane Liers, Taina Lundell: New and classic families of secreted fungal heme peroxidases. In: Appl Microbiol Biotechnol July 2010, Volume 87, Issue 3, pp 871–897 DOI: 10.1007/s00253-010-2633-0 https://doi.org/10.1007/s00253-012-4521-2 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093700 Witoon Purahong, Danuta Kapturska, Marek J. Pecyna, Elke Schulz, Michael Schloter, François Buscot, Martin Hofrichter, Dirk Krüger: Influence of Different Forest System Management Practices on Leaf Litter Decomposition Rates, Nutrient Dynamics and the Activity of Ligninolytic Enzymes: A Case Study from Central European Forests. In: PLoS ONE 9(4): e93700 doi:10.1371/journal.pone.0093700 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0095557 Harald Kellner, Patricia Luis, Marek J. Pecyna, Florian Barbi, Danuta Kapturska, Dirk Krüger, Donald R. Zak, Roland Marmeisse, Micheline Vandenbol, Martin Hofrichter: Widespread Occurrence of Expressed Fungal Secretory Peroxidases in Forest Soils. In: PLoS ONE 9(4): e95557. doi:10.1371/journal.pone.0095557 doi:10.1371/journal.pone.0095557 born digital Molecular biological charaterization of heme-thiolate and DyP-type peroxidases of selected basidiomycetes Marek Pecyna +491638116265 pecyna@ihi-zittau.de doctoral_thesis